中国攻关联盟解析新冠要害 筛选出多种病毒抑制小分子

　　经国际权威学术刊物《自然》（Nature）邀请投稿，当地时间4月9日，来自中国的“抗新冠病毒攻关联盟”正式发表了题为“Structure of Mpro from COVID-19 virus and discovery of its inhibitors”的研究。该研究揭示了2.1 新冠病毒Mpro（又称3CLpro）与 N3复合物的高分辨率结构，这也是世界上第一个被解析的新冠病毒蛋白质的三维空间结构。

　　他们还分析探讨了多种药物发现策略，该研究为迅速开发具有临床潜力的抗新冠肺炎的药物奠定了重要基础。通过计算机辅助药物设计，攻关团队确定了新冠病毒主蛋白酶的强效抑制剂N3。此外，团队还进行了10000多种化合物的筛选，发现了双硫仑（disulfiram）、卡莫氟（carmofur）、依布硒（ebselen）、紫草素（shikonin）、Tideglusib和PX-12等多种对主蛋白酶有显著抑制作用的药物。

　　据中科院药物所介绍，上述“抗新冠病毒攻关联盟”由上海科技大学-清华大学饶子和/杨海涛团队、中科院上海药物所蒋华良团队、军事科学院军事医学研究院秦成峰团队以及中科院武汉病毒所石正丽团队、肖庚富团队等组成。国家蛋白质科学中心（上海）主任兼上海科技大学生命科学与技术学院教授许文青、澳大利亚昆士兰大学的Luke W. Guddat教授也参与了此项研究。

　　该项研究的通讯作者为上海药物所研究员兼上海科技大学免疫化学研究所特聘教授蒋华良院士、清华大学教授兼上海科技大学免疫化学研究所特聘教授饶子和院士、上海科技大学免疫化学研究所课题组长杨海涛研究员（兼生命科学与技术学院副教授）。

　　新冠疫情在中国尚处于爬坡期的1月25日，中国科学院上海药物研究所曾宣布：由蒋华良院士和饶子和院士领衔、20余个课题组参与的中国科学院上海药物研究所和上海科技大学免疫化学研究所抗新冠病毒感染联合应急攻关团队筛选出了30种具备治疗潜力的药物。随后的1月26日，饶子和/杨海涛课题组测定的新冠病毒主蛋白酶（Mpro）的高分率晶体结构对外公布，以便有更多的科技工作者、特别是从事药物研发的科技人员使用。

　　新冠病毒是一种单链RNA正链包膜乙型冠状病毒，入侵细胞后，新冠病毒会立即利用细胞内的物质合成自身复制必需的两条超长复制酶多肽（pp1a和pp1ab）。这两条复制酶多肽需要被剪切成多个零件（如RNA依赖的RNA聚合酶、解旋酶等等）；这些零件进一步组装成一台庞大的复制转录机器，然后病毒才能启动自身遗传物质的大量复制。

　　两条复制酶多肽的剪切要求异常精确，因此病毒自身编码了一把神奇的“魔剪”——主蛋白酶Mpro。Mpro在复制酶多肽上存在至少11个切割位点，只有当这些位点被正常切割后，这些病毒复制相关的“零件”才能顺利组装成复制转录机器，启动病毒的复制。

　　正是由于主蛋白酶在病毒复制过程中起到至关重要的作用，且人体中并无类似的蛋白质，因此主蛋白酶就成为一个抗新冠病毒的关键药靶，抑制这种酶的活性将有效阻止病毒复制。

　　值得一提的是，除了主蛋白酶Mpro，此次疫情期间，饶子和团队还领衔成功解析了新型冠状病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）的结构，率先探讨了广受关注的抗病毒药物瑞德西韦（GS-5734）治疗新冠肺炎的病毒靶标。其团队在SARS（严重急性呼吸综合征）疫情暴发期间，就曾在世界上解析了首个SARS病毒蛋白质（主要蛋白酶）的三维空间结构。

　　全球首次解析新冠病毒“主蛋白酶-N3”三维空间结构

　　研究团队通过质谱法测定了COVID-19病毒Mpro的分子量为33797.0 Da，与其理论分子量33796.8 Da相符。

　　在此前的研究中，研究团队使用计算机辅助药物设计设计了迈克尔受体抑制剂N3，该抗体可以特异性抑制多种冠状病毒主要蛋白酶，其中包括SARS-CoV（严重急性呼吸系统综合征冠状病毒）和MERS-CoV（中东呼吸系统综合症冠状病毒）的Mpro。

　　研究人员接下来构建了新冠病毒Mpro的同源性模型，并使用分子对接来确定N3是否可以靶向这种新的冠状病毒的Mpro。

　　研究人员发现，一个对接形态表明N3可以进入底物结合口袋（the substrate-binding pocket），而这一“口袋”恰恰因为高度保守性而可以作为设计广谱抑制剂的药物靶标。

（左）新冠病毒主蛋白酶-抑制剂N3的复合物结构；（右）冠状病毒主蛋白酶的底物结合口袋是一个保守药物设计靶点

　　随后，研究团队利用晶体衍射技术，获得了分辨率为2.1埃的N3与Mpro复合物结构。在新冠病毒主要蛋白酶结构中，结构域I和结构域II形成六链反平行β-桶形结构，在它们之间的裂缝中带有底物结合位点，即药物靶标“口袋”。

　　值得注意的是，早在1月26日，研究团队测定的Mpro高分率晶体结构已在PDB蛋白质结构数据库（Protein Data Bank, PDB）上公开。自1月26日起，团队已为国内外300多家高校、研究机构及企业的实验室直接提供了数据。该结构也被PDB蛋白质结构数据库选为2020年2月的明星分子（February Molecule of the Month）。

　　事实上，随着新冠疫情在全球暴发，科学家们一直在努力寻找有效的病毒抑制剂。此前3月20日，《科学》（Science）杂志发表了德国吕贝克大学生物化学研究所Rolf Hilgenfeld等人的研究，他们通过对新冠病毒主要蛋白酶结构的解析，对此前的抑制剂进行了优化，并认为一种名为13b的α-酮酰胺抑制剂显示出明显的肺向性，并且适用于通过吸入途径给药。

　　多种策略筛选潜在药物：依布硒和N3均能在细胞水平显著抑制新冠病毒复制

　　目前，对于新冠病毒的治疗还没有特效药物。为了快速发现具有临床潜力的抗病毒化合物，研究团队还开发了一种结合从头设计、虚拟药物筛选和高通量筛选的策略，以确定现有药物是否能靶向COVID-19病毒的Mpro。

　　与N3结合的新冠病毒Mpro复合物结构对于通过计算机筛选来鉴定潜在靶向药物提供了一种模型，研究人员进而建立了潜在结合化合物的内部数据库。

　　结果表明，肉桂硫胺（cinanserin）能够与底物结合口袋紧密结合，对Mpro的IC50（半抑制浓度）值为125μM。

　　肉桂硫胺是一种血清胺拮抗制剂，在1960年代已在人体中进行了初步临床测试，并且先前已显示出抑制SARS-CoV的Mpro的作用。肉桂硫胺在上世纪70年代用于治疗精神分裂症，对冠状病毒3CL水解酶具有抑制作用。

　　团队认为，它具有作为抗新冠病毒药物的优化潜力。为了表征其酶促活性并进行抑制剂的高通量筛选，研究团队开发了一种荧光共振能量转移（FRET）分析方法。

　　接下来，攻关“联盟”继续联合利用虚拟筛选和高通量筛选策略相结合的方式，对10000多个老药、临床药物以及天然活性产物进行筛选，发现了数种对主蛋白酶有显著抑制作用的先导药物，其中包括双硫仑（disulfiram）、卡莫氟（carmofur）、依布硒（ebselen）、紫草素（shikonin）、Tideglusib和PX-12等。

　　其中，依布硒对于新冠病毒Mpro的抑制作用最强。值得一提的是，依布硒已用于治疗听力障碍等多种疾病的临床试验（完成临床二期），并具有很好的安全性表现。

　　为了进一步证实它们体外的酶促抑制结果，研究人员进行了后续的抗新冠病毒实验，结果表明，依布硒和N3均能在细胞水平显著抑制新冠病毒的复制。

　　攻关团队表示，“在这一研究中，基于结构的从头设计、计算机虚拟筛选和高通量筛选三种研究策略的结合被证明是找到针对抗新冠病毒药物的有效策略。”

　　研究者们认为，这种筛选策略有效性较高，可以快速发现具有临床潜力的药物，以应对尚无特定药物或疫苗的新传染病。