流式大咖说|流式检测中最易忽视的时间参数——首都医科大学中心实验室副主任技师徐晓雪
流式检测中最易忽视的时间参数
徐晓雪
上期，首都医科大学中心实验室副主任技师徐晓雪老师带我们学习了流式新手绕不开的数据处理难题——如何去黏连？（点击阅读），本期我们将跟随徐老师探究流式检测中最容易忽视的一个参数！
常见的流式细胞术教材中都会对常用的一些流式检测参数进行介绍，包括前向、侧向散射光信号，荧光强度，这些通常会出现在流式的检测结果中，用于展示流式数据，大家可以参看各种技术书籍，这里我们要介绍的是一个很少出现在流式检测结果图片中但又是检测结果中必不可少的参数，这就是时间参数，当我们进行流式检测选取检测参数时并没有一个表示时间的参数存在，但在数据显示界面的参数列表中除了FSC,SSC,FL1-n之外，大家会发现自动多一个参数Time，这就是我们要介绍的时间参数，它不能被选择采集，可见它的必要性，但它又很少出现在结果图片中，也许你不曾注意到它，但它就像流式数据的影子一直伴随流式数据存在，只要你在仪器上采集数据就会同时生成时间参数，因为它的记录并不需要操作者手工选取，所以也容易被人忽视。
什么是时间参数，它记录了每个检测颗粒被采集的时间点，以时间为坐标从检测开始为时间零点，每个检测颗粒位于一个确定的时刻，在diva软件中时间坐标的单位为10ms，检测颗粒按照采样的顺序依次分布，直到最后一个信号点显示采样结束的时间，可以反应采样过程的全部时长以及每个信号的具体采集时刻。
时间参数的意义：流式可以被看作是流动的显微镜，对于一般的显微镜聚焦观察的视野是固定不动的，调节准确后可以清晰成像，但是流式细胞仪是在流动的鞘液中聚焦飞速流过的颗粒，即使光学部件固定不动，调节准确，仍然是在检测运动的目标，目标颗粒和包裹的鞘液每时每刻都在变化，可见流体聚焦是一个相对的稳定过程，液体压力的改变，颗粒大小、运动速度的差异都可能造成信号的波动，在检测中观察检测稳定性的最好指标就是看信号的时间变化轨迹，正常的流动条件下的检测信号相呈现出稳定的窄幅波动，在荧光（散射光）vs时间参数图中分布均匀、没有间断、跃起或塌陷，对于已经完成检测的数据，时间参数用来观察数据质量，判断样品中出现的差异信号是真正的检测结果还是信号的异常波动，它也是检测后提示数据质量的重要判断依据。
说到这里时间参数具体有什么用处呢？下面我们一一举例说明。
1. 检测中监控仪器稳定状态：上样速度、检测点稳定性?
在流式检测中用信号强度的差异代表颗粒特征的差异，但是由于检测在运动中进行，液流中的异常波动可能会造成检测状态的变化，造成信号的异常波动，严重的情况需要暂停上样，恢复理想液流后再检测，为了及时发现这些异常情况，需要监控信号-时间变化情况，如图，如果图上出现信号的降低、中断或异常波动需要暂停上样进行故障排除，这是时间参数最普遍的应用，信号vs时间坐标图是检测过程中不可缺少的监控指示。
2.? 连续检测样品的动态变化：起始状态、加药刺激、变化信号检测通常需要时间参数标志?
时间参数另一个应用在于检测动态变化的细胞信号，比如检测细胞内钙离子变化，需要在检测之初建立钙荧光vs时间参数图，采集一定数量的初始细胞作为基础值，取下样品，加入刺激药物，再次上样，可以记录随时间变化的细胞钙荧光变化，也可以间隔不同时间点采集细胞，形成随时间变化的细胞钙荧光强度定量变化，数据可以根据不同时间点进行分段统计分析荧光定量变化。此种采样适用于检测同一细胞样品的荧光信号变化。在此类检测中变化指标-时间图用来说明样品的变化，其他固定不变的指标，比如SSC-时间图可以作为检测稳定性的监控参数。
在样品中加入刺激试剂后绿色荧光明显增强
3. 数据采集后识别无效信号，提示检测故障?
在检测后数据分析中往往容易忽视对数据质量的评价，我们可以根据荧光-时间图大体判断采样的质量，对于大量样品的处理往往会遇到个别质量较差的数据，可以通过这一参数的做图，快速判断检测稳定的样品与检测异常的样品，选取优良的检测数据进行后续分析，较新版的FlowJo软件就具有数据质量检查功能，使用的就是各通道信号强度中值对时间的变化识别异常信号，质量差的数据会被标记为红色。
数据质量检查红色提示检测异常的信号
4. 数据分析中剔除劣质信号，提高数据质量?
也有可能采样发现有的时间段检测信号有波动，大部分信号平稳，而检测本身又比较重要或不可重复，这时只有通过荧光-时间双参数图发现个别区域信号出现波动，但整体数据较平稳，这样可以通过在分析中优先设定选时门，把个别信号波动的检测颗粒排除掉，只选取采样质量较好的部分进行数据统计分析。如图，通过截取检测稳定的数据，可以排除结果中的异常信号。新版的FlowJo软件可以自动分析并筛除异常波动信号提高分析数据的质量和可靠度。
5. 根据时间缩减数据量?
除了需要剔除质量差的信号，我们还有时为了统一样品的分析颗粒数目需要减少已经采样的数据的细胞数目，一些软件提供了可以随机将样品减少到固定数目的处理，但是颗粒选取不可控，如果采用时间设门，也可以同样控制分析细胞的数目，只需要在分析逻辑门上游设置时间参数门，可以自如的控制选取相同数目的分析细胞，提高做图的一致度。
6．其他情况?
有些情况需要将一组不同样品数据合并后进行综合分析，如果对数据的编号信息有所混淆，在合并后的数据中时间参数可以帮助识别不同的样品和上样的时间顺序，如图样品采集的时间间隔清晰可见，利用它可以在区分样品的同时观察样本数据的质量，设门观察任意数量的分析群体。
时间参数的使用不仅仅局限于上面的例子，只要我们了解了流式时间参数的意义就可以进行灵活的组合和选取，实现相关的分析功能，不过需要指出，最最重要的还是在采集流式数据时，一定不要忽略了对信号vs时间双参数图的观察，很多流式数据的瑕疵都可以通过采样中的质量监控避免，只有采集状态稳定可靠才能得到可信的差异数据。下一次如果您遇到异常的流式结果，不妨调出时间参数看一看。
作者简介
徐晓雪 首都医科大学中心实验室 副主任技师（KOL主页）
徐晓雪，首都医科大学中心实验室流式平台负责人，副主任技师，2006年毕业于首都医科大学生理学专业，获理学硕士学位，加入首都医科大学医学实验与测试中心工作，同年在北京大学医药卫生分析中心学习流式技术，一直从事流式技术服务工作至今，熟悉多种型号高级流式仪器的性能与操作，参与服务多项首都医科大学及其附属医院的国家级、省部级科研项目，主要研究方向为流式细胞分析技术，始终致力于流式新技术的引进、应用与推广。
本文编辑：刘立东
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